4月18日,生物学杂志《蛋白质与细胞》(Protein &
Cell)在线发表了中山大学副教授黄军就的研究[1]:他们利用一种叫做CRISPR/Cas9的工具成功修改了多个人类三原核受精卵中编码血红蛋白beta亚基的基因HBB,这是第一次发表编辑人类胚胎基因组的研究。这一结果不但揭示了基因组编辑技术走向临床前必须攻克的若干技术问题,也重燃了生命科学界的一个重大争论——人类是否应该修改自身的基因。

有目标性位点的靶向核酸酶被广泛用于基因组编辑。2013 年第一次将
Crispr/cas9
技术用于基因组编辑以来,这个领域发生革命性的变化。作为基因组编辑工具,Crispr/cas9
最成功的地方是它可以轻松的设计向导性 RNA 序列将 Cas9
引导到基因组的特定位点上,然后通过 Cas9 的核酸酶切割活性造成 DNA
断裂。最近的几项研究,成功地应用 Crispr/cas9
纠正动物模型,体细胞和体外诱导的多能干细胞中引起疾病的突变基因,这也对基因组编辑技术应用于临床燃起了希望。我们对近期应用
Crispr/cas9 技术用于基因治疗研究做一综述。

长期以来,由于缺乏足够高效的工具,对包括人类在内的灵长类动物进行基因修饰一直是个根本无从下手的难题。而CRISPR/Cas9系统的横空出世,直接将这个长期停滞不前的进程一举推进到了实际应用的阶段。大约在一年前,昆明动物所的季维智研究员利用CRISPR/Cas9系统成功制造出了两只经过基因修饰的嵌合体猕猴,从而证明了CRISPR/Cas9系统在灵长类身上的可行性[2],自此编辑人类基因也就是一个时间问题了。

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美高梅在线登录网址 2世界上第一对利用CRISPR/Cas9技术得到的基因修饰猴,图片来自:参考资料2

规律成簇间隔短回文重复序列配合与它相关的Cas蛋白赋予细菌或古生菌防御外源入侵的核酸,如噬菌体和质粒
DNA[1]。目前为止已经发现的 Crispr/cas9
系统有三种类型,研究得最为透彻的是第二种类型[2]。在细菌防御反应中,外源性DNA会被切割成很多小段,插入到CRISPR位点旁,然后被转录成Cr-RNA前体,继续通过剪切变成成熟的
Cr-RNA 。相应的反义链上会经过转录和转录后加工,形成一个互补的 traCr-RNA
,跟Cas9核酸酶形成核蛋白复合体继续识别和切割入侵的外源 DNA[2]。2012
年,Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna 用二型 Crispr/cas9
技术对酿脓链球菌基因组进行编辑[3]。Cr-RNA 和 traCr-RNA
形成一个向导性的 sgRNA,通过 Watson-Crick
互补配对原则定位到基因组特定位点,招募Cas9核酸酶过来切割 DNA,造成 DNA
双链断裂反应[3,
4]。Crispr/Cas9复合体通过两种不同的机制对基因组进行编辑。第一种方式是在缺少同源性DNA模板时,DSB
损伤修复主要是通过非同源末端连接,这是一种容忍差错的修复,会引起小的插入和缺失。第二种方式是在同源性
DNA
模板存在情况下,通过同源重组的方法进行精确修复,也可以对特定的核苷酸序列进行替换[5,
6]。

黄军就的团队也考虑了实验伦理问题,他们刻意挑选了一种不能正常发育成个体的畸形受精卵——这些受精卵是在人工授精过程中,一个卵子意外被两个精子同时受精而产生,它会形成一种具有三套染色体(三倍体)的异常胚胎,因而无法正常发育。而且,研究团队只让这种受精卵存活了48小时(大约会发育到八细胞期)便终止发育。

在 Crispr/cas9 之前,主要是用锌指核酸酶和 TALEN 技术进行 DNA
编辑。但是,涉及这种特异性识别DNA序列的蛋白基序非常耗时,这严重影响了技术的发展[7,
8]。Crispr/cas9技术具有锌指核酸酶和TALEN技术无法比拟的可操作性,广泛应用于各种物种的DNA编辑,包括人和灵长动物[9-12]。这些研究表明
Crispr/Cas9
有望应用于基因治疗,可以改变引起疾病的基因的核酸序列。我们对最近应用
Crispr/cas9
技术用于基因治疗研究做一归纳。首先介绍一下,体内条件下,Crispr/cas9
直接针对受精卵和成体动物。再综述一下,通过体外培养细胞,用 Crispr/Cas9
体外敲除基因,这这些修饰过的细胞回输入病人体内,成功控制病人疾病的案例。

美高梅在线登录网址 3美高梅在线登录网址 ,黄军就团队选取的三原核受精卵。图片来源:参考资料1

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不过即便如此,这项研究还是在业内掀起了不小的争议。据《自然》新闻的消息,黄军就本人表示,他的这项研究没能发表在诸如《自然》或《科学》等国际一线期刊的原因之一就是伦理争议[3]。伦敦大学的遗传学家雪莉·霍奇森(Shirley
Hodgson)表示:“我认为这样的研究已经明显远离了目前可接受的科研范畴。”

1.Crispr/cas9对受精卵基因组编辑

那么,这样的技术是否应当用于人类自身呢?一种声音认为,这些基因改造技术可以用来帮助遗传病患者,让他们及其后代都免除家族性疾病的梦魇。事实上,自从CRISPR/Cas9技术问世以来,已经有一系列的动物实验表明,有针对性地对胚胎[4]乃至成年个体[5]使用这类技术,可以达到传统方法难以比拟的疗效。如果类似的方法被用在人类身上,受益人数势必难以估量。然而目前,在英国和德国等欧洲国家,对人类生殖系进行基因操纵的研究是被法律禁止的,而在美国,这样的研究只能在严格的管制下用非联邦的经费进行。肯特大学的生物学教授戴伦·格里芬(Darren
Griffin)说:“随着CRISPR/Cas9的广泛运用,(像黄军就团队)这样的研究结果迟早会出现。如果这项技术被证明是安全的,问题才变成将这项技术运用到临床是否有违伦理道德。“

共同注射 Cas9 的信使 RNA 或者蛋白,sgRNA 和 HDR
模板到受精卵或早期胚胎中可以改变所有细胞的基因组,包括生殖细胞。因此,这种方法造成的基因组改造可以遗传到子代个体中,为消除家族性的遗传疾病提供可能。上海生化细胞所的李劲松研究员首次报道用
Crispr/cas9
技术修复小鼠胚胎中引起疾病的突变基因。他们矫正了小鼠白内障显性突变基因
Crygc。他们将 Cas9的信使 RNA 和靶向 Crygc 基因的 sgRNA
同时注射到受精卵中,修复时以同源染色体上正常的基因做模板,进行同源重组修复,最后矫正了的小鼠的白内障[13]。另一项研究用
Crispr/Cas9
在小鼠胚胎中矫正肌萎缩蛋白基因,这种疾病是X染色体连锁的遗传性疾病[14]。在这项研究中,科研人员们同时注射Cas9
信使 RNA,sgRNA
和单链寡核苷酸片段一起到受精卵中进行HDR修复。尽管作者们只获得了部分细胞得到矫正的嵌合体,是由于
DNA
编辑发生后受精卵分化的之后,通过自然选择后依然得到了表型完全矫正的小鼠。在最近的一项研究中,研究人员用
Crispr/cas9
技术在人胚胎细胞中中进行了基因组编辑[15],引发了一些生物伦理方面的争论[16,
17]。研究报道说在人胚胎的三原核合子中修改血红素β基因,这个基因突变会造成地中海贫血症。研究人员也发现了
Crispr/cas9 技术存在着脱靶风险,带来很多不知道的 DNA
编辑,现在的技术用于临床还存在风险。现有的产前检测技术,比如体外受精后遗传筛选可以筛选掉存在先生性疾病的胚胎。生殖细胞基因组编辑主要也为那些需要优化孩子一些性状基因,如智商,相貌等等提供了可能。处于更多的安全和伦理问题,并不建议将
Crispr/cas9 技术用于人合子基因组编辑合法化。

然而,即便抛开伦理因素,黄军就的研究也证明这项技术目前还远未成熟。对三原核受精卵中HBB的修改遭遇了不小的障碍。研究者对54个经过基因修改并存活下来的三原核受精卵进行了基因检测,其中只有28个的目标片段被成功剪切。此外,包括本次中山大学的研究在内,大量基于CRISPR/Cas9等新兴基因编辑技术的研究都报道了一种称为“基因脱靶”(off-target
effect)的现象,也就是说,这些技术有一定的几率去“篡改”靶标序列以外的基因。这种伤及无辜的概率虽然不高,但是考虑到在胚胎中这种改变会被人世世代代地遗传下去,因此从临床角度看,研究者必须对这种风险采取零容忍的态度。实际上,这一技术的效率和脱靶效应一直是一对很难解决的矛盾,效率提升的同时脱靶效应就会加剧,反之亦然。这个矛盾已成为CRISPR/Cas9走向临床应用的最大障碍。

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在学术界内部,对于编辑人类基因的做法也是质疑声不断[6],其中最尖锐的批评莫过于对现有基因编辑技术的风险担忧。甚至有科学家建议[3]说,在我们找到合理的方向之前,这类研究应该全部暂停。爱丁堡大学的布鲁斯·怀特洛(Bruce
Whitelaw)教授指出:“这项结果表明基因组编辑技术的使用正在被拓展,但同时也强调了许多应用还亟待技术优化。基因组编辑固然是一项令人兴奋的技术工具,但它仍然还处在发展阶段。“

2.Crispr/cas9对体细胞的体内编辑

据悉[3],目前中国至少有四家实验室正在开展编辑人类胚胎基因的相关工作。英国克里克研究所的罗宾·巴杰教授表示(Robin
Lovell
Badge):“我预期今年将会有若干个类似的研究发表,黄军就和同事的这项实验结果只是首篇。”截至发稿时,黄军就并未就此项研究对果壳网科学人做出回应。

Yin 等人运用 Crispr/cas9
技术成功地对出生后Ⅰ型酪氨酸血症小鼠进行矫正[18]。Ⅰ型酪氨酸血症在遗传学上是由于缺少
fumarylacetoacetate hydrolase
酶引起的,导致肝细胞代谢毒物的积累而造成细胞死亡。通过尾静脉注射 Cas9
载体,特异性的 sgRNA 和 DNA 模板在小鼠肝脏细胞进行同源重组修复。突变的
FAH 酶被矫正,肝细胞毒性减弱,小鼠的体重回升。酪氨酸血症非常适合用
Crispr/cas9 系统进行基因治疗,起初只有大约 0.4%
的肝细胞被矫正,后来通过肝细胞增殖和突变的肝细胞的死亡,整个肝脏机会恢复正常。

参考资料:

  1. Liang, P., Xu, Y., Zhang, X., Ding, C., Huang, R., Zhang, Z., … &
    Huang, J. (2015). CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human
    tripronuclear zygotes. Protein & Cell, 1-10.
  2. Niu, Y., Shen, B., Cui, Y., Chen, Y., Wang, J., Wang, L., … &
    Sha, J. (2014). Generation of gene-modified cynomolgus monkey via
    Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell, 156(4),
    836-843.
  3. David Cyranoski& Sara Reardon. (2015) Chinese scientists
    genetically modify human embryos. Nature
    News
  4. Wu, Y., Liang, D., Wang, Y., Bai, M., Tang, W., Bao, S., … &
    Li, J. (2013). Correction of a genetic disease in mouse via use of
    CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell, 13(6), 659-662.
  5. Yin, H., Xue, W., Chen, S., Bogorad, R. L., Benedetti, E., Grompe,
    M., … & Anderson, D. G. (2014). Genome editing with Cas9 in adult
    mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature
    biotechnology.
  6. Edward Lanphier, Fyodor Urnov, Sarah Ehlen Haecker, Michael Werner&
    Joanna Smolenski. Don’t edit the human germ line. Nature News

另外一项体内研究是关于敲除小鼠肝脏细胞中 proprotein convertase
subtilisin /kexin type 9
[19]。PCSK9从肝细胞中分泌到血浆中,作为低密度脂蛋白受体激动剂,它控制低密度脂蛋白的摄取与降解。天然出现的PCSK9
突变会减少血液中的胆固醇水平。为了模拟天然出现的情况,研究者用
Crispr/cas9 腺病毒载体在小鼠肝脏细胞中敲除 PCSK9。这导致 PCSK9
蛋白水平的降低和低密度脂蛋白受体的升高。更为重要的是,这种方法是通过NHEJ方法造成肝细胞PCSK9的突变,效率高达50%,这足够用于临床治疗。

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